摘要
放射性食管炎是放射治疗最常见的急性不良反应，严重者会导致身体不适、疼痛，甚至死亡。然而，患有这种疾病的患者还没有直接的治疗方法，其中，摄取和酸反流对受损的食管粘膜的有害影响仍然是一个悬而未决的问题。
近期，浦项科技大学的DongWooCho课题组在Biomaterials期刊上发表了“Therapeuticeffectofdecellularizedextracellularmatrix-basedhydrogelforradiationesophagitisby3Dprintedesophagealstent”的文章，使用旋转复合3D打印方法制造了含脱细胞基质dECM的水凝胶+PCL支架，用以解决炎症反应，促进再生微环境，是一种治疗放射性食管炎的有前途的治疗策略。
即：
通过支架平台的水凝胶输送，研究团队目的是评估组织特异性脱细胞细胞外基质(DECM)水凝胶对受损组织的再生能力，为此，研究团队研制了一种食管源性dECM(EdECM)，并证明其具有优越的生物功能和流变特性，以及物理稳定性，潜在地为组织发育提供了更好的微环境。使用旋转杆组合3D打印系统连续制作了EdECM水凝胶支架，该系统显示了结构的稳定性，并在输送过程中保护了加载的水凝胶。最后，在放射性食管炎大鼠模型上观察EDECM对支架置入后的治疗效果。研究结果表明，通过支架平台输送EdECM水凝胶可以迅速消除炎症反应，从而促进促进再生的微环境。这些结果为放射性食管炎的治疗提供了一种很有前途的治疗策略。
以食道炎为特征的放射性食管炎会导致不良后果，包括不适、疼痛，甚至死亡。它是放射治疗(RT)最常见的急性不良反应，被广泛用于治疗和缓解癌症相关症状。各种与细胞死亡相关的机制可以通过辐射诱导的损伤被激活，导致DNA损伤、应激诱导的信号通路的激活和促炎细胞因子的释放。在食道中，粘膜细胞的持续更替使其特别容易受到RT损伤。剥脱和溃疡可能是由于粘膜炎症的进展和基底上皮变薄所致。然而，目前还没有直接治愈放射性食管炎的方法，摄食和酸反流对受损的食管粘膜的有害影响仍然是一个未解决的问题。现如今，医学界已经提出了两种治疗方法：1）插入支架以打开狭窄的食道以减轻患者的吞咽困难，2）提供支持治疗。当前可用的治疗涉及旨在缓解症状的简单治疗干预。除了禁食，抗生素和肠胃外营养支持等几种支持疗法外，食管内生物活性分子或治疗药物的递送已显示可大大减轻食管炎症。然而，口服这种治疗通常需要重复递送，并且由于食道蠕动导致快速冲洗而可能导致功效有限。这突显了对设计用于靶向受损组织的基本治疗方式的需求，表明需要一种功能性医疗装置，通过该装置可提供持续的局部治疗效果而不会受到食道各种身体运动的干扰。支架是一种广泛使用的医疗设备，它可以提供足够的通畅性，防止导管样组织(如动脉粥样硬化)阻塞，最近它发展成为一种能够输送药物的设备，包括抗增殖药物、抗代谢药物和免疫抑制药物。具体地说，食道支架在临床实践中用于多种食道疾病和状况的内窥镜治疗。食管支架的一个主要缺点是它们与相对较高的不良事件风险相关，例如复发性吞咽困难和胸骨后疼痛，限制了它们在临床实践中的使用。然而，目前还没有直接治疗放射性食管炎的功能性支架；仅靠食管支架不能减轻食管炎，这导致组织愈合不能对抗放射性食管炎。为了防止不良反应，可以根据药物的特定用途使用不同的方法将几种药物装载到支架表面。涂层是覆盖整个支架表面的最简单方式之一，在药物输送平台中起着重要作用，而使用溶剂和聚合物的传统涂层方法可能会形成几微米厚的薄层药物。然而，这可能会造成材料浪费、装载效率降低以及不可避免的风险。为了克服这些缺点，即使载药水凝胶在制造过程中受到高剪应力，也可以使用水凝胶加载作为一种替代策略，通过该策略来实现所结合药物的高加载效率和极好的稳定性3D生物打印的出现允许组织工程构建体的高精度制造以及结构控制。这种3D生物打印技术通过以自动化方式直接操纵复杂的几何形状来制造3D结构具有广阔的前景。借助这种新颖的生物制造技术，基于ECM的水凝胶已成为制造3D生物打印结构的重要组成部分。在这项研究中，研究者利用食道来源的dECM（EdECM）水凝胶用于食管支架的制造，本研究是第一个打印EdECM水凝胶支架用于局部治疗放射性食管炎的研究(图1)。
图1.当前研究的示意图。采用旋转杆联合3D打印系统(2RPS)制备了食管来源的脱细胞细胞外基质(EdECM)水凝胶支架。将聚己内酯(PCL)逐层挤出到旋转杆上，制成带容器的支架支架，以容纳EdECM水凝胶。然后将EDECM水凝胶沉积到这个储集层框架中。同时建立放射性食管炎大鼠模型。用自制导管将制作好的支架植入动物模型的食管内。
PS：这项研究中，研究团队假设食管源性细胞外基质(EdECM)水凝胶对放射性食管炎有组织愈合作用。因此，研制了一种EdECM水凝胶，并对其流变特性和生化特性进行了验证。此外，还利用“旋转杆结合3D打印系统”(2RPS)研制了哑铃状支架。这种支架采用了一种新颖的设计，包括能够容纳水凝胶和药物等生物活性物质的外部开槽储存库结构，这是传统激光切割方法无法生产的特征。此外，我们还建立了放射性食管炎大鼠模型，观察EdECM水凝胶支架的治疗效果。
对于水凝胶配方，将EdECM粉末溶解在含有10%(w/w)胃蛋白酶的0.5M醋酸溶液中(Sigma-Aldrich，美国)3天。溶解的EDECM用10M氢氧化钠中和至生理pH值(Sigma-Aldrich，美国)。中和的EDECM预凝胶溶液在4?C新鲜储存3-4天，直到需要为止(图2A)。从为组织再生提供组织/器官特异性微环境的角度来看，脱细胞ECM被认为是一种很有前途的生物材料。脱细胞的目的是去除细胞成分，同时保留天然组织的关键细胞外基质成分。如图2A所示，通过应用物理、化学和酶处理，成功地从猪食管组织中获得了EdECM。
图2.EDECM水凝胶的研制。(A)食管的脱细胞过程。(B)EDECM组件的量化。(C)细胞存活率；(D)与胶原相比，EdECM的增殖。
研究团队提取食道来源的dECM（EdECM）水凝胶用于食管支架的制造，与1％和2％的EdECM水凝胶以及3％的胶原水凝胶相比，3％的EdECM水凝胶具有优异的剪切回复率，流变耐久性，稳定性和相对较低的降解率。因此，选择3％EdECM作为进一步体内应用的最佳水凝胶浓度（图3A）。另外，随着EDECM浓度的增加，EDECM水凝胶(3%)表现出更强的剪切变稀行为。为了考察热敏交联过程，研究了EDECM和COL预凝胶在4~37?C温度范围内的凝胶动力学。EDECM和COL水凝胶的复模量(G*)在温度超过15?C后都有增加的趋势，在生理温度(37?C)下迅速增加。这一结果表明，当温度超过15?C时，EDECM和COL预凝胶都会转变为类凝胶相，在37?C的30分钟内形成交联凝胶(图3B)。
图3.不同浓度(1%、2%和3%)的EdECM水凝胶与3%胶原的流变学评估：(A)粘度、(B)凝胶动力学、(C)频率扫描、(D)应力扫描、(E)剪切恢复曲线和(F)剪切恢复率。
本研究中使用的支架被认为满足三个要求：1)它包含一个外部开槽结构，用作血管内皮细胞外基质(EdECM)储存器，从而提供在进食过程中免受洗涤的保护；2)它具有足够的灵活性，可以适应植入部位的颈部运动，以及3)它被牢固地固定，以防止支架移位。根据上述要求，储液罐在食管壁一侧打开，在另一侧关闭(图4A-I)。此外，通过在支柱之间存在桥梁可以实现灵活的结构(图4A-II)。最后，支架的两端都有一个哑铃状的形状，旨在起到锚的作用(图4A-III)。此外，由于EdECM水凝胶的剪切恢复，可以在打印后立即在储液器中恢复足够的粘度，从而防止水凝胶从储液器泄漏。
图4.(A)不同尺寸的3D打印食管支架(I)-储液器，(Ii)-桥，和(Iii)-哑铃状。(B)EDECM负载食管支架植入。(C)导管的外部和内部。(D)带食管支架的组合导管。
最终PCL和EdECM材料被交替复合生物3D打印在一个旋转轴上，一体打印成一个食管支架。
食管支架打印视频
为了建立放射性食管炎大鼠模型，研究团队通过5次分次剂量(12Gy/次)进行胸部照射。首先，确定照射组(n=5)和未照射组(n=3)摄食量和体重的变化。两组受照动物(IR组和IRST组)在受照期间每日摄食量均呈下降趋势，第9天体重减轻约90%(图5A)。相比之下，非辐射组(CTRL组)的每日摄食量和体重都显示出很小的变化(图5A)。此外，在5次照射后，照射组可观察到食道肿胀(图5B)。为了观察食管层的病理损害，进行了组织学评估，包括HE、MT和PAS染色(图5C)。照射组的结果显示上皮变薄，粘膜下层相对肿胀。粘膜层和粘膜下层均可见炎性细胞浸润和空泡形成。此外，两层都显示松散和紊乱的胶原纤维(图5C)，这与先前研究中观察到的组织学表现相似。
总之，放射性食管炎是在大鼠模型上建立的，在该模型中观察了进行性病理特征，包括进食量、体重、食管病理和基因表达的变化。这些结果表明，5次分次剂量12Gy/次对大鼠放射性食管炎的诱导是有效的。因此，我们利用这一大鼠模型进一步评价了血管内皮细胞基质支架在预防和治疗辐射方面的有效性。
图5.放射性食管炎大鼠模型的建立。(A)每日进食量和体重变化。(2)第9天食管大体观察。(3)第9天苏木精-伊红(HE)、马逊三色蓝(MT)和高碘酸-希夫(PAS)染色(比例尺：μm)。(D)第9天炎性细胞因子、细胞外基质重塑和生长因子信号的基因表达分析。
组织学上，IR组在第16天观察到由病理生理进展引起的严重炎症(图6A)。具体地说，表现为食管层模糊和粘膜组织受损的破坏性上皮。更多的炎性细胞浸润到所有食管层，包括固有肌层。IR组空泡形成增多，粘膜下层胶原纤维变形。
导管的导入装置
相反，在IRST组中，携带EdECM的支架(IRST-w/Stent，图6B-I)附近的组织完全恢复到正常状态；存在明显而明显的食管层，以及重建的上皮，但很少观察到炎症细胞和空泡的形成。IRST组支架区粘膜下层也形成致密的胶原纤维网络。
结果，在IRST-w/支架区域观察到炎症反应减轻，食管组织最终愈合。此外，我们的研究结果显示，在EDECM支架(IRST-w/o支架，图6B-II)附近的非邻近区域有少量炎症。然而，与IR组的组织学表现相比，IRST组W/O支架区域的食管组织在组织形态学和炎症反应方面都显示出更好的预后。
图6.第16天苏木精伊红(HE)、马森氏三色蓝(MT)和高碘酸-希夫(PAS)染色的组织学观察。(A)各组的组织学形态(比例尺：μm)。(B)EDECM水凝胶支架置入组的典型组织学图像：(I)-w/stent，(Ii)-w/o支架区域(比例尺：μm)。
为了评价支架置入对辐照食管愈合的影响，我们还检测了促炎细胞因子的基因表达谱，包括肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、干扰素γ、白细胞介素-6和干扰素β，以及生长因子信号通路，包括血管内皮生长因子、转化生长因子-β和白细胞介素-10(图7b)。在第16天，我们观察到IR组和IRST组的基因表达水平均高于CTRL组。
值得注意的是，与其他组相比，胰岛素抵抗组肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-1β基因水平显著上调。转化生长因子-β和白细胞介素-10这两种促再生细胞因子的基因表达在胰岛素抵抗组和胰岛素抵抗组均显著增加。IR组和IRST组IL-6和VEGF基因表达差异无统计学意义。通过组织学检查和基因表达分析证实，植入EdECM支架后，食管损伤恢复和炎症消退，我们认为EdECM可能有助于促进宿主的组织重塑，从而有助于炎症反应的快速消退和组织修复。
图7.携带EdECM的食管支架在第16天对愈合的影响。(A)免疫荧光染色和定量分析炎症反应。(B)炎性细胞因子和生长因子信号的基因表达分析。
为了更清楚地确定再生食管中存在的相关炎症细胞的数量，研究团队使用免疫荧光染色观察了免疫细胞的分布（图7A）。综上所述，研究团队开创性的提出了放射性食管炎的直接治疗干预策略。可以从食道的ECM中提取EdECM水凝胶以治疗食道炎。通过使用旋转复合生物3D打印技术，可以制造带有外部开放凹槽结构的PCL支架以装载EdECM水凝胶。在辐射性食管炎大鼠模型中评估了装载有EdECM的支架，并证实了其治疗效果，这表明局部治疗具有广阔的临床前景。此外，这项研究表明，在不使用药物或细胞的情况下，组织特异性dECM水凝胶可以用作从辐射诱发的炎症中恢复的关键要素。它可以扩展到治疗其他基于炎症的局部损伤，例如伤口，烧伤或组织坏死。由于水凝胶可用于细胞包裹，因此这种组织特异性dECM水凝胶可作为各种所需药物的细胞载体的潜在生物材料。这项研究表明，装有组织特异性dECM水凝胶的支架可能成为有希望的平台，可用于输送治疗性细胞和/或药物来管理复杂多样的疾病。
参考文献：Dong-HeonHa,etal.Therapeuticeffectofdecellularizedextracellularmatrix-basedhydrogelforradiationesophagitisby3Dprintedesophagealstent.Biomaterials,.DOI:
